Explicado: ¿Por qué varias personas con síntomas de Covid dan negativo en las pruebas?
Muchas personas con síntomas de Covid-19 han dado negativo en las pruebas. Hay varias razones probables, como las mutaciones del virus que escapan a la detección, la calidad del muestreo y las pruebas, y la eficacia de los kits de RT-PCR.
Las pruebas pueden fallar en varias etapas, desde una mala recolección y almacenamiento de muestras hasta una extracción y amplificación defectuosas. (Foto exprés: Vishal Srivastav) Mientras India lucha por hacer frente a la demanda sin precedentes de pruebas de RT-PCR, los informes sugieren que hasta un 20% de los pacientes sintomáticos con Covid-19 dan negativo.
Esta aparente tendencia de resultados falsos negativos puede negar la admisión hospitalaria y cuidados intensivos de pacientes graves, al tiempo que permite que los asintomáticos se muevan y propaguen el virus. La tendencia ha llevado a los expertos, incluido el director de AIIMS, el Dr. Randeep Guleria, a recomendar el tratamiento con Covid-19 para todas las personas que muestren síntomas clásicos independientemente de los resultados de RT-PCR.
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Por que falsos negativos
Las pruebas de RT-PCR, consideradas el estándar de oro en el diagnóstico de Covid-19, no están destinadas a ser perfectas. La sensibilidad mínima (capacidad para detectar positivos) exigida por el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR) para validar una prueba de RT-PCR es del 95%. Eso significa que se esperan hasta un 5% de resultados falsos negativos.
Si bien los informes anecdóticos sugieren que la proporción de resultados negativos falsos está aumentando en toda la India, aún no hay ningún estudio que respalde esto.
En teoría, cuatro factores generales determinan la precisión de una prueba de RT-PCR: la carga viral en la persona, la calidad de la recolección y el procesamiento de la muestra, la eficacia del kit de prueba en sí y también el punto de referencia para la interpretación de la prueba.
LA CARGA VIRAL: Por lo general, Covid-19 se manifiesta adecuadamente hacia el quinto día de un ciclo de infección. Probado antes de la exposición posterior, una persona infectada puede resultar negativo para Covid. Esto puede no ser un factor importante detrás de la reciente tendencia de falsos negativos, ya que ciertos mutantes de Covid-19 aparentemente muestran síntomas tempranos.
A varios pacientes sintomáticos que dieron falso negativo en los ensayos de RT-PCR se les confirmó posteriormente que eran positivos para Covid en las pruebas de lavado broncoalveolar (BAL) que recogen muestras del tracto respiratorio inferior a través de un broncoscopio. Esto ha llevado a conjeturar que ciertos mutantes eluden el tracto respiratorio superior para apuntar al pulmón, un escenario que puede negar una prueba de RT-PCR, basada en una muestra recolectada de la cavidad nasal y la garganta, la carga viral requerida para un resultado preciso.
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EXPLOSIÓN DE CAPACIDAD: El número de laboratorios de pruebas de Covid en India aumentó de 14 en febrero de 2020 a más de 2400 en abril de 2021. Una expansión tan rápida requirió la aprobación de cientos de laboratorios para pruebas de RT-PCR y la capacitación de miles de técnicos a toda prisa.
Como medida de seguridad, ICMR en julio de 2020 enumeró 30 laboratorios de control de calidad para verificar todos los laboratorios de Covid que aprobó. Desde entonces se han agregado otros 8 laboratorios de control de calidad. Sin embargo, fuentes de varios laboratorios en tres estados dijeron que solo se llevaron a cabo algunas inspecciones de instalaciones e instrumentos.
Idealmente, se debe tomar una mezcla de muestras positivas y negativas al azar de cada laboratorio periódicamente para volver a realizar las pruebas. ¿Eso fue alguna vez hecho? Si. ¿Eso fue hecho de manera consistente? No, dijo un científico de un instituto de ICMR que no está autorizado para hablar con los medios.
Abordados para el monitoreo periódico del laboratorio y los datos de cumplimiento de la calidad desde julio de 2020, el ICMR y varios laboratorios de control de calidad permanecieron en silencio.
ELEMENTO HUMANO: Las pruebas pueden fallar en varias etapas, desde una mala recolección y almacenamiento de muestras hasta una extracción y amplificación defectuosas. Todos los kits de RT-PCR incluyen un control interno (IC) para protegerse contra un escenario en el que no se extrae / amplifica ARN, lo que da lugar a un falso negativo. La CI puede ser exógena o endógena. Es exógena cuando se agrega una molécula de plantilla de ARN artificial a cada muestra antes de la extracción de ARN. La prueba se considera nula cuando el ARN sintético no se detecta después de la extracción y se prescribe una nueva prueba. Y un control endógeno utiliza un gen humano 'doméstico' presente en la muestra; su no detección después del procedimiento de extracción de ARN invalida la prueba.
Un gen humano doméstico también asegura la calidad de la muestra ... Pero más del 75% de los kits de RT-PCR en el mercado indio utilizan controles internos exógenos más baratos, dijo un biólogo molecular de Mumbai.
El SOP de abril de 2020 de ICMR sobre RT-PCR sostuvo que se puede ignorar el control exógeno para la extracción, ya que no reflejará la calidad de la muestra recolectada. Recomendó la RNasa P separada o cualquier otro gen humano doméstico ... debe ejecutarse en paralelo en un tubo separado ... (para) verificar tanto la calidad de la muestra recolectada como el procedimiento de extracción.
En mayo de 2020, la mega licitación presentada por ICMR / HLL para kits de RT-PCR especificó requisitos similares. Varios fabricantes argumentaron que diferentes empresas utilizan diferentes controles internos, incluidos los exógenos, que fueron aprobados por agencias reguladoras como la FDA y CEIVD, y que la selección adversa basada en genes domésticos desalentaría la competencia leal. Finalmente, la licitación fue revisada para incluir opciones tanto endógenas como exógenas para el control interno.
MUTACIÓN VIRAL: Una prueba RTR-PCR se dirige a áreas específicas de uno o más genes virales para detectar su presencia. Una prueba puede arrojar resultados falsos negativos si se produce una mutación en el segmento del genoma evaluado. Las pruebas que utilizan múltiples objetivos genéticos, como las que se utilizan en la India, tienen menos probabilidades de ser engañadas por mutaciones.
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Los reguladores como la FDA de los EE. UU. Monitorean de manera rutinaria el impacto de las mutaciones en las pruebas de RT-PCR Si bien expertos como el Dr. Rakesh Mishra, director del Centro de Biología Celular y Molecular (CCMB) de Hyderabad, creen que el ICMR debería iniciar un ejercicio similar, puede que no sea así. fácil de monitorear en tiempo real más de 200 kits de RT-PCR aprobados en India contra mutaciones emergentes.
Por un lado, ningún fabricante ha hecho (o hará) públicas las secuencias detalladas a las que se dirigen sus pruebas. Mientras se envían para su validación al ICMR, solo mencionan los genes diana y no la secuencia del cebador, dijo un investigador principal del Ministerio de Salud.
Sin embargo, hasta ahora, hay motivos para sentirse bastante seguro incluso en ausencia de una verificación de eficacia en tiempo real. Hasta ahora, las variantes de Covid-19 tienen principalmente mutaciones en el gen S (proteína de pico). La mayoría de los kits aquí utilizan regiones conservadas (sin cambios) de objetivos, dijo la Dra. Shanta Dutta, directora del Instituto Nacional de Cólera y Enfermedades Entéricas (NICED), Kolkata.
Caída de precios
En un año, el precio del kit de RT-PCR cayó de más de 1.100 rupias a menos de 40 rupias. Dado que se retiró la exención de derechos de importación en octubre de 2020, la mayoría de las marcas extranjeras abandonaron el mercado indio debido a la carga adicional del 15%. Varias marcas indias también se han negado a vender por debajo de 100 rupias. Muchas han encontrado clientes corporativos dedicados a quienes no les importa pagar un poco más para garantizar la calidad. Algunos incluso ofrecen varios kits de PCR a diferentes niveles de precio.
Si bien nadie lo dice oficialmente, muchos cuestionan la calidad de la competencia más barata. La contraposición es que todos los kits de prueba disponibles en el mercado cumplen con los parámetros de validación de ICMR y que cualquier guerra de precios en última instancia beneficia al consumidor.
Sin embargo, no todo el mundo está convencido. La caída correspondiente en el costo de la prueba de laboratorio es de Rs 4.500 a Rs 800. Además, ¿alguien que visita su laboratorio local para una prueba Covid sabe qué kit se está utilizando? ¿Cuántos laboratorios gastarán 100 rupias cuando puedan salirse con la suya usando un kit de 40 rupias? dijo uno de los primeros fabricantes indios de kits de PCR Covid.
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El Valor ct
Una prueba de RT-PCR amplifica el ácido nucleico extraído de la muestra para detectar el específico del virus Covid-19. La amplificación ocurre en ciclos con un valor de umbral (Ct). Claramente, cuanto mayor es la presencia / carga viral, menor es el valor de Ct o el número de ciclos de amplificación necesarios para que sea detectable.
ICMR estableció el valor Ct en 35 para resultados negativos. Más allá de esto, cualquier rastro de virus potencialmente presente se considera insignificante y la muestra se considera negativa para Covid.
Pero ciertos estados como Maharashtra buscaron extender el límite de admisibilidad sugiriendo un valor Ct de 24. Como esto excluiría potencialmente a un gran número de personas con una carga viral cuantitativamente más baja pero clínicamente significativa, ICMR reiteró su posición sobre un valor Ct de 35 .
Sin embargo, hay poca claridad si todos los estados siguen el mismo punto de referencia Ct. Según los altos ejecutivos de al menos dos redes de laboratorios de varios estados, han recibido instrucciones verbales contradictorias y, en ocasiones, injustificadas sobre dichos parámetros de prueba. Incluso una prueba molecular no es inmune al sesgo subjetivo.
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